由于具有抗炎、抗凋亡、抗菌和抗纖維化特性，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MSC) 被認(rèn)為是治療呼吸系統(tǒng)疾病的一種有前途的替代方法。盡管 MSC 給藥已在臨床試驗(yàn)中被證明是安全的，但迄今為止，很少有研究表明MSC對呼吸系統(tǒng)疾病有效。
提高間充質(zhì)干細(xì)胞治療呼吸系統(tǒng)疾病的效果的方法有哪些？
本綜述介紹了增強(qiáng)MSC有益作用的策略，包括預(yù)處理（在缺氧、氧化應(yīng)激、熱休克、血清剝奪和暴露于炎性生物樣品下）和基因操作。這些策略可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)來不同程度地促進(jìn)MSC存活率的提高，并通過改善修復(fù)因子的分泌來提高M(jìn)SC的效力。此外，這些策略已被證明可以增強(qiáng)MSC在臨床前肺病模型中的有益作用。然而，要將這些策略從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化為臨床，還有很長的路要走。
間充質(zhì)干細(xì)胞在治療呼吸系統(tǒng)疾病中的潛力
間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）處于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域前沿。其有明確特征，人類MSC培養(yǎng)時會粘附在塑料上，表達(dá)特定細(xì)胞表面標(biāo)志（如CD105、CD90、CD73），缺乏另一些標(biāo)志（如CD45、CD34、CD14），且在誘導(dǎo)劑存在下能體外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。過去十年還證實(shí)其具備免疫調(diào)節(jié)特性，可抑制多種免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及B和T淋巴細(xì)胞）的增殖、成熟和分化。
MSC通過多種機(jī)制減輕炎癥，
- 一是通過在細(xì)胞外囊泡等部位分泌旁分泌/內(nèi)分泌介質(zhì)（如激素、細(xì)胞因子、生長因子等），這些分泌因子有抗炎、抗凋亡等多種活性；
- 二是借助細(xì)胞間接觸，靠配體與受體識別影響免疫細(xì)胞；
- 三是通過細(xì)胞器轉(zhuǎn)移（如線粒體）來發(fā)揮作用。
鑒于上述機(jī)制，MSC被視作肺部疾病（如急性呼吸窘迫綜合征、過敏性哮喘、肺氣腫、矽肺病等）的潛在療法，相關(guān)臨床前研究中展現(xiàn)出的有益作用推動了臨床試驗(yàn)開展。雖然臨床試驗(yàn)表明其安全性良好，但MSC治療的潛在功效有限，這可能是受接種量少（圖1a)、在肺部疾病病程晚期給藥、體內(nèi)存活率低（圖1b）以及效力/生物活性受損（圖1c）等多種因素影響。
a：接種的MSC數(shù)量少。此外，盡管MSC在全身給藥后很容易被困在肺毛細(xì)血管中，但無法長期保留。因此，修復(fù)因子的數(shù)量逐漸減少。
b：MSC易受炎癥微環(huán)境毒性的影響，導(dǎo)致體內(nèi)存活率低。剩余的少數(shù)存活MSC可能不足以發(fā)揮足夠的治療效果。
MSC在肺部的植入是細(xì)胞治療面臨的一大阻礙，據(jù)估算，MSC在24小時內(nèi)就會從肺組織中被清除。目前主要測試了兩種解決該問題的策略：
一是讓MSC過表達(dá)表面受體CXCR-4，其能與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1相互作用，以此支持MSC歸巢至受損部位，使得在急性肺損傷模型中，更多MSC可進(jìn)入并定居肺部；
二是采用磁靶向技術(shù)將MSC募集到肺組織中，不過該技術(shù)雖能提高48小時后的細(xì)胞保留率，但其有效性尚未得到確切評估。
另外，為提高M(jìn)SC的存活率或效力以增強(qiáng)其有益作用，也提出了兩種策略。
其一是預(yù)處理，它以生物學(xué)興奮效應(yīng)概念為基礎(chǔ)，即讓MSC短暫接觸低劑量的有毒或致命藥劑來產(chǎn)生有益效果（如應(yīng)激耐受性生長或長壽）；
其二是基因操作，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或運(yùn)用miRNA、小干擾RNA（siRNA）來對參與細(xì)胞存活途徑和免疫調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。
而本綜述旨在描述并討論上述這些策略，以及它們在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中是怎樣對肺部疾病治療起到促進(jìn)作用的。
提高間充質(zhì)干細(xì)胞存活率的策略
MSC療法要想成功，需要有合適數(shù)量的細(xì)胞，為此會在含富含生長因子的動物血清的培養(yǎng)基里對MSC進(jìn)行體外擴(kuò)增。但連續(xù)復(fù)制、培養(yǎng)條件以及凍融等情況可能會給細(xì)胞帶來損害，導(dǎo)致它們在面對受損組織的惡劣環(huán)境時更為脆弱。
近期有數(shù)據(jù)表明，新鮮解凍的MSC可能無法具備與新鮮培養(yǎng)的MSC相同的效果以及抗炎活性范圍，不過也有研究小組報告稱，在實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘中，解凍的MSC和新鮮培養(yǎng)的MSC效果一樣。
所以，還需要進(jìn)一步深入研究，去評估新鮮和解凍的MSC在不同疾病模型以及不同體內(nèi)環(huán)境下的有效性情況。 預(yù)處理策略已經(jīng)被拿來測試，目的是保護(hù)MSC免受受損環(huán)境影響，進(jìn)而提升其存活率。部分研究聚焦于MSC在亞致死性暴露于細(xì)胞應(yīng)激源（比如缺氧、高溫、營養(yǎng)耗竭等）時的反應(yīng)（圖2），這些應(yīng)激源與缺血或炎癥微環(huán)境類似，它們被視作是體內(nèi)細(xì)胞存活面臨的主要挑戰(zhàn)。
除了預(yù)處理外，還嘗試操縱與重要細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活途徑有關(guān)的基因，以嘗試提高M(jìn)SC存活率。例如，過表達(dá)肝細(xì)胞生長因子 (HGF) 的MSC在體內(nèi)表現(xiàn)出存活率提高，其效果已在肺損傷模型中得到測試。
提高間充質(zhì)干細(xì)胞存活率的預(yù)處理策略
缺氧預(yù)處理
缺氧預(yù)處理能夠讓 MSCs 在缺血性微環(huán)境中存活，對于治療與氣體交換障礙（如急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、哮喘和肺纖維化等）相關(guān)的肺部疾病有較好效果。在肺纖維化模型中，和常氧條件下培養(yǎng)的 MSCs（NP-MSCs）相比，缺氧預(yù)處理的 MSCs（HP-MSCs）在減輕博來霉素引起的氣道收縮、肺水腫以及纖維化變化等方面效果更顯著，并且通過使用 lacZ 報告基因的 MSC 轉(zhuǎn)導(dǎo)評估細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，HP-MSC治療組在18天后肺組織中的lacZ mRNA含量比NP-MSC組高出三倍，由此推測肺功能和組織學(xué)的改善或許與缺氧預(yù)處理提高M(jìn)SC存活率相關(guān)。
通過氧化應(yīng)激暴露、熱休克蛋白和血清剝奪進(jìn)行預(yù)處理
通過暴露于氧化應(yīng)激、熱休克蛋白、血清剝奪這幾種方式對間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）進(jìn)行預(yù)處理的策略，尚未在肺病模型中開展測試，但體外和體內(nèi)研究結(jié)果顯示這些策略具備應(yīng)用潛力。
氧化應(yīng)激預(yù)處理
- 作用及效果：氧化預(yù)處理不僅能促進(jìn)細(xì)胞保護(hù)作用，還可提高M(jìn)SC效力。先前讓MSC暴露于非致死濃度的過氧化氫（20和50μM）時，其對致死劑量該化合物的抵抗力更強(qiáng)，對照組（0μM）約60%的MSC處于細(xì)胞凋亡狀態(tài)，而20和50μM組分別約30%和40%處于凋亡狀態(tài)。
- 分子機(jī)制：其細(xì)胞保護(hù)涉及的分子機(jī)制是MSC線粒體瞬時釋放活性氧（ROS），進(jìn)而激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路，該通路能促進(jìn)如Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達(dá)，此策略或許有助于治療以肺部微環(huán)境中ROS釋放為特征的炎癥疾病（如急性呼吸窘迫綜合征、矽肺病等）。
熱休克預(yù)處理
- 效果表現(xiàn)：熱休克預(yù)處理是增加MSC存活率的一種有效方法。將MSC暴露于42°C下60分鐘，可使熱休克蛋白-27（HSP-27）和熱休克蛋白-90（HSP-90）表達(dá)分別增加4.8倍和17.4倍。
- 作用機(jī)制及局限：這些熱休克蛋白通過激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K/AKT）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和核因子κB（NF-κB）等信號通路促進(jìn)MSC存活，但盡管熱休克預(yù)處理的MSC有潛在應(yīng)用價值，卻從未在體內(nèi)進(jìn)行過測試。
血清剝奪（SD）預(yù)處理
- 目的及效果：血清耗竭預(yù)處理旨在讓MSC處于靜止?fàn)顟B(tài)以減少能量需求，利于其在缺血環(huán)境中存活。在相關(guān)報告中，讓MSC在無胎牛血清情況下培養(yǎng)48小時后植入動物體內(nèi)，在缺血條件下維持3和7天，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SD預(yù)處理組在第3天和第7天的MSC活力分別增加了四倍和三倍。
- 機(jī)制闡釋：在SD預(yù)處理期間，生長因子缺失會抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路（更具體說是mTOR復(fù)合物1，即mTORC1），mTORC1會抑制自噬等分解代謝過程，而經(jīng)過48小時SD預(yù)處理后，MSC內(nèi)源性自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3B-II蛋白水平高于對照細(xì)胞，且當(dāng)自噬受到抑制時，半數(shù)MSC在缺血條件下培養(yǎng)7天后死亡，所以經(jīng)此預(yù)處理的MSC存活率提高可能得益于保護(hù)性自噬過程。
運(yùn)用基因操作提升間充質(zhì)干細(xì)胞存活率的情況
多種遺傳方法被用于提高間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）的存活率，雖然多數(shù)此類方法旨在增強(qiáng)MSC對缺血環(huán)境的抵抗力以改善心肌梗死治療，但肝細(xì)胞生長因子過表達(dá)的MSC（HGF-MSC）也在急性肺損傷模型中進(jìn)行了測試。肝細(xì)胞生長因子（HGF）本身是一種具備抗炎、抗凋亡以及修復(fù)特性的生長因子。
HGF-MSC在細(xì)胞凋亡及效力方面的表現(xiàn)
- 細(xì)胞凋亡情況：在體外將細(xì)胞暴露于過氧化氫（120μM）4小時后，HGF-MSC的凋亡率低于未修飾的細(xì)胞（HGF-MSC的Annexin-V陽性細(xì)胞占比為25.3%，而未修飾細(xì)胞為64.6%），且在體內(nèi)，HGF過表達(dá)后，凋亡細(xì)胞數(shù)量近乎減少了一半，不過HGF提升MSC存活率的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。
- 細(xì)胞效力提升表現(xiàn)：HGF的上調(diào)還提高了MSC的效力。與野生型MSC相比，HGF-MSC使肺組織中的HGF水平得以提高，并且改善了氧合情況（動脈血氧分壓，PaO?水平方面，HGF-MSC為104.62±10.5 mmHg，野生型MSC為90.30±8.8mmHg），降低了肺損傷評分（HGF-MSC為0.3，野生型MSC為0.55），減少了中性粒細(xì)胞浸潤（髓過氧化物酶活性方面，HGF-MSC約為600 mU/g，野生型MSC約為700 mU/g），提高了超氧化物歧化酶（SOD）水平，還上調(diào)了白細(xì)胞介素-10（IL-10，HGF-MSC約增加4倍，野生型MSC約增加2倍）。
關(guān)于凋亡間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)情況
已測試了多種策略來提高M(jìn)SC在體內(nèi)的存活率，不過值得注意的是，有報告顯示即便處于凋亡狀態(tài)的MSC也具備免疫調(diào)節(jié)活性。比如在哮喘模型中，注射10?個凋亡的MSC相較于存活的MSC以及未進(jìn)行治療的情況，發(fā)揮了免疫抑制作用，使支氣管肺泡灌洗液（BAL）中的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤顯著減少一半；在膿毒癥模型中，用凋亡的MSC進(jìn)行治療可改善動脈血氧飽和度，并減少肺損傷（體現(xiàn)為肺重與體重比方面，凋亡MSC治療時約為0.45 × 10?2，對比情況約為0.4×10?2），但凋亡的MSC改善治療結(jié)果的作用機(jī)制目前仍不清楚。
提高間充質(zhì)干細(xì)胞效力的策略
MSC“效力”被定義為其生物活性的量度；它也是治療效果與達(dá)到治療效果所需的MSC劑量之間的關(guān)系。MSC效力低可能是MSC在體外擴(kuò)增過程中表型發(fā)生變化的結(jié)果。此外，MSC不會自發(fā)產(chǎn)生免疫抑制；需要事先激活才能提高其效力。因此，了解導(dǎo)致MSC激活的機(jī)制非常重要。
炎癥環(huán)境中影響MSC的相關(guān)因素
在存在炎癥的微環(huán)境里，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞會釋放諸如干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1、趨化因子、白三烯以及自由基等促炎介質(zhì)，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）能夠“感知”這些介質(zhì)，進(jìn)而激活核因子κB（NF-κB），促使免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)因子的表達(dá)增多。
此外，還有其他因素可激活MSC，例如微生物相關(guān)分子模式能通過Toll樣受體（TLR），像TLR3和TLR4來激活MSC。其中，通過脂多糖（LPS）激活TLR4會誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎性MSC表型，使其分泌IL-6、IL-8和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β；而通過聚肌苷酸：聚胞苷酸（poly I:C）激活TLR3則會誘導(dǎo)出抗炎性MSC表型，使其表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶、前列腺素（PG）E2、IL-4和白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）。
基于炎癥環(huán)境的提高M(jìn)SC效力的策略
提高M(jìn)SC效力的首個策略是在炎癥環(huán)境中對其進(jìn)行預(yù)處理。就肺部疾病而言，中度至重度急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者的混合血清被當(dāng)作激活MSC的炎癥背景來使用。這種血清含有高水平的IL-10、IL-8和IL-6，以及低水平的IL-1β、TNF-α和IFN-γ。當(dāng)使用0.5%的ARDS血清對MSC預(yù)處理16小時后，與對照MSC相比，MSC的IL-10（約為5倍）和白細(xì)胞介素1受體拮抗劑（IL-1RN，約為2.5倍）的表達(dá)顯著增加，并且ARDS血清還能降低促炎介質(zhì)的表達(dá)（詳見表1）。
使用其他物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理
人們對探索提高 MSC 效力的替代方法很感興趣，最近的研究已經(jīng)探討了MSC與其他物質(zhì)的結(jié)合。這些物質(zhì)包括吡格列酮、N?-乙酰半胱氨酸和粉防己堿（表1）。
基因操作增強(qiáng)MSC
多種促有絲分裂、抗凋亡以及抗炎因子已被高效轉(zhuǎn)導(dǎo)至間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）中，這些經(jīng)過基因操控的細(xì)胞在急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、肺動脈高壓（PAH）以及慢性阻塞性肺病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭薪邮芰藴y試。
針對ARDS進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況 ARDS是此類技術(shù)常見的治療目標(biāo)，為有效逆轉(zhuǎn)炎癥過程，MSCs被轉(zhuǎn)導(dǎo)了以下幾種基因：
- 發(fā)育內(nèi)皮基因座1（Del-1）：它是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，在細(xì)胞遷移和浸潤方面起著關(guān)鍵作用。
- ST2受體基因（sST2）：作為白細(xì)胞介素-33（IL-33）的捕獲受體，IL-33-ST2軸在肺部炎癥期間連接著先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。
- 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE-2）：該酶能夠降低血管緊張素-2（Ang-2）水平，而Ang-2是ARDS發(fā)病機(jī)制中的重要介質(zhì)。
- 錳超氧化物歧化酶（MnSOD）：其可保護(hù)線粒體免受活性氧（ROS）的侵害。
轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的MSCs在小鼠ARDS模型中的效果
在小鼠ARDS模型中測試時，轉(zhuǎn)導(dǎo)了上述基因的MSCs展現(xiàn)出諸多積極效果，具體表現(xiàn)為：
- 顯著降低：肺損傷指數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、促炎細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-β和/或白細(xì)胞介素-6）水平以及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白質(zhì)含量。
- 部分提升與改善：提高了抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10的水平，減少了肺水腫以及肺組織中的細(xì)胞凋亡率，還提高了小鼠的生存率（相關(guān)效果總結(jié)于表2中）。
重要的是，轉(zhuǎn)基因基質(zhì)細(xì)胞在臨床環(huán)境中的應(yīng)用即將成為現(xiàn)實(shí)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞已獲批準(zhǔn)，目前正在用于肺動脈高壓患者的早期臨床研究，如肺動脈高壓和血管生成細(xì)胞治療 (PHACeT) 試驗(yàn)。
結(jié)論
間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛力。然而，MSC在呼吸系統(tǒng)疾病方面的臨床試驗(yàn)的主要結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于這些細(xì)胞在臨床前研究中的理論潛力。將MSC移植轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N有效的程序是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。研究人員一直在尋找替代且有效的策略來提高植入MSC的存活率和免疫調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)組織修復(fù)。然而，盡管如本綜述所述，有大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明存在一系列改善MSC功能的策略，但這些技術(shù)要從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用到臨床應(yīng)用還有很長的路要走。
參考資料：Silva, L.H.A., Antunes, M.A., Dos Santos, C.C.?et al.?Strategies to improve the therapeutic effects of mesenchymal stromal cells in respiratory diseases.?Stem Cell Res Ther?9, 45 (2018). https://doi.org/10.1186/s13287-018-0802-8
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