在生物醫(yī)學飛速發(fā)展的當下，多能干細胞的研究為神經系統(tǒng)疾病的治療帶來了前所未有的曙光。其中，來自多能干細胞的神經細胞藥物，正逐漸從實驗室的理論設想邁向臨床應用的現實。這一創(chuàng)新療法不僅有望重塑神經系統(tǒng)疾病的治療格局，更可能為無數患者帶來新的希望。本文將深入探討這類神經細胞藥物從研發(fā)構思到臨床前評估的每一步歷程，剖析其背后復雜而精妙的科學進程。

1.有關神經系統(tǒng)疾病及干細胞治療神經系統(tǒng)疾病的介紹

神經系統(tǒng)是人類各種認知和運動功能的控制中心，神經系統(tǒng)紊亂會導致嚴重的神經系統(tǒng)疾病。近年來，神經系統(tǒng)疾病已成為全球死亡和殘疾的一個重要原因，例如神經退行性疾病和神經損傷，2016年分別影響了900萬人和2.76億人。由于中樞神經系統(tǒng)(?CNS?)的自我修復能力有限，針對中樞神經系統(tǒng)疾病的治愈方法仍然很少。

長期以來，細胞替代療法一直是治療神經系統(tǒng)疾病的一種非常有前景的方法。胎兒腦源性神經干細胞 (NSC) 和腹側中腦 (VM) 組織分別在治療中風和帕金森病 (PD)?方面表現出積極作用。然而，由于倫理限制和細胞質量的變化，胎兒組織的應用往往受到限制。人類多能干細胞 (hPSC)，包括人類胚胎干細胞 (hESC) 和人類誘導多能干細胞 (hiPSC)，由于其無限的自我更新能力和向所需外胚層細胞類型的多分化潛力，為移植提供了可行的神經元細胞來源。到目前為止，幾種 hPSC 衍生的神經元細胞類型已在神經系統(tǒng)疾病模型中成功測試，并已證明其體內安全性和有效性。一些國家還啟動了首次人體臨床研究。

不過，細胞衍生物制備和質量評估挑戰(zhàn)重重，涉及細胞類型選擇、分化階段確定、動物模型構建、質量控制等多方面，這嚴重阻礙了干細胞臨床應用和商業(yè)化。

鑒于各國要求不同，監(jiān)管政策有差異。國際干細胞銀行計劃匯聚研究人員，發(fā)表系列文件，就多能干細胞臨床轉化達成全球共識，涵蓋質量控制、倫理等方面，推動了轉化并保障細胞產品質量安全，還與其他組織合作推進細胞藥物制造標準化。

將多能干細胞轉化為神經細胞藥物要經過開發(fā)、生產和臨床前評估三大工序

在干細胞治療帕金森病領域，GForce-PD發(fā)揮國際協(xié)調作用。本文總結干細胞治療臨床前研究原則，為學術產品開發(fā)者提供指導，實際應用需遵循當地法規(guī)^[1]。

2.早期原則和產品開發(fā)

2.1 細胞獲取的倫理原則

• hESC和hiPSC依賴人類捐獻者，獲取捐獻者細胞需遵循國際公認原則（如ISSCR 2016指南）與當地法律法規(guī)。
• 每個細胞系必須有捐獻者 / 主治醫(yī)生簽署的知情同意書，以及醫(yī)院的倫理支持文件。
• 要告知捐獻者隱私保護的限制，以滿足安全性和可追溯性需求。

2.2 細胞供體的選擇

• 需對胚胎或細胞捐獻者進行仔細風險評估，篩查各類潛在人類傳染性病原體，如 HIV、HBV、HCV 等嚴重血源性病毒性疾病。
• 根據捐獻者選擇過程中的信息，考慮篩查其他生物體。
• 專業(yè)評估還應考量遺傳病。
• 建議收集捐獻者血液樣本的ABO血型、HLAI類和 II 類基因型信息，用于檢查衍生細胞系身份，以及匹配細胞系血液和組織類型，降低患者免疫反應。

2.3 適當的神經細胞類型

• 合適的細胞分化條件決定神經元細胞多樣性，不同細胞表型特性和功能各異。
• 帕金森病由黑質中腦多巴胺能神經元（mDA）丟失引發(fā)，只有mDA細胞能在帕金森病模型中建立正確連接，獲得治療效果，前腦/后腦神經元無效。
• 肌萎縮側索硬化癥（ALS）特征為上下運動神經元丟失，由反應性星形膠質細胞毒性引起，除移植運動神經元，移植健康星形膠質細胞改善微環(huán)境也是有效治療方法。
• 腦損傷、中風和脊髓損傷等涉及多種神經細胞功能喪失和微環(huán)境變化，使用單一神經元細胞恢復連接有挑戰(zhàn)，神經干細胞（NSC）能分化成神經元且分泌神經營養(yǎng)因子，是有前途的治療細胞類型。

2.4 移植細胞的階段

• 基于 hPSC 的神經替代療法，移植階段的選擇很關鍵。
• 早期神經祖細胞存活神經元產量高，但有不受控制增殖風險；成熟神經元移植后存活率差。
• 移植細胞的存活情況和動物模型行為改善可提示適當的移植階段。需找出不同階段（增殖祖細胞、有絲分裂后神經母細胞、成熟神經元）的特定標志物。
• 帕金森病細胞治療研究中，早期有絲分裂后神經元應用最廣泛；星形膠質細胞移植中，譜系限制性祖細胞應用廣泛，但各制造階段最佳細胞表型仍待進一步研究。

3.細胞制造質量控制的一般考慮因素

3.1 質量管理體系

• 完善的質量管理體系（QMS）對確保細胞庫運營和細胞生產的可靠輸出極為關鍵，建議遵循適用于許可產品的良好生產規(guī)范（GMP）。
• QMS 需針對制造產品，明確制造商責任、采用標準及所有制造程序摘要，涵蓋捐贈者樣本收集、原材料選擇等一系列操作程序與質量文件。
• QMS 要保證從原材料到最終產品的所有材料和程序具有可追溯性，通常在質量手冊中闡述一般程序、相關標準和政策。

3.2 細胞株存庫流程

• 制備臨床細胞產品的首要步驟是確保建立 hPSC 的供體適用性，保存生產細胞的早期庫存，選擇符合 GMP 標準的科學質量控制和安全測試線。
• 依據適用標準選擇和鑒定試劑及材料，如 “無異種” 和化學成分明確的培養(yǎng)基等。
• 為減少不同批次細胞差異，建議采用包含主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB）的多級細胞庫系統(tǒng)作為生產培養(yǎng)物供應起點。

3.3 hPSC 的質量控制

• hPSC 作為起始材料，其質量對確保最終產品的質量和可重復性意義重大。
• 需對細胞庫材料進行適當的質量控制檢測，包括細胞形態(tài)、活力、DNA 指紋等多項測試。
• hPSC 的批次間差異可能是工藝差異的主要來源，因此需開發(fā)大量同一批次的 hPSC 。

3.4 產品過程管理

• 整個生產過程中，必須嚴格把控細胞產品質量。質量管理體系應在關鍵步驟指明特定的質量控制測試，如細胞標志物和微生物測試，以保證提供具有特定傳代水平的可重復細胞制劑。
• hPSC 衍生產品的生產過程主要包括 hPSC 生產和神經元細胞生產兩部分。hPSC 生產中，擴增時要進行過程測試以確保其保持內在特性；神經元細胞生產中，在分化過程的不同時間點進行多項質量控制測試，文中圖1總結了當前通用的已發(fā)布工作流程。

3.5 移植細胞的純度

• hPSC 神經替代療法的關鍵挑戰(zhàn)是獲取高同質性目標細胞類型。需明確最終細胞產品全部組成并清除殘留干細胞，因其有安全風險。
• 臨床證據顯示，污染的5-羥色胺神經元可致PD患者移植物誘導的運動障礙，臨床前研究表明殘留祖細胞會在腦或脊髓中異常增殖或形成結構。
• 部分研究團隊采用特定表面標志分選細胞、添加槲皮素等策略提高純度，且需驗證無未分化細胞。

3.6 細胞配制和保存

• 細胞作為“活藥物”，其生物過程持續(xù)進行且受環(huán)境影響，建立有效保存制度很關鍵。
• 細胞制劑分新鮮非冷凍和冷凍保存兩類。新鮮細胞活力和特性好但壽命短，不適合長期儲存和全面質控；冷凍細胞保質期長，可進行質控和安全放行測試，但凍融有損傷等問題。
• 應選擇適合神經元細胞的冷凍保存液，并驗證冷卻、解凍條件，且解凍后24小時細胞活力和恢復情況可準確反映冷凍效果，同時要按 ICH Q5C 指南研究細胞產品儲存和運輸穩(wěn)定性。

3.7 細胞產品放行測試

• 細胞產品關鍵質量屬性是體內安全有效的前提，需對產品批次按預定比例測試。
• 評估系統(tǒng)包括生物污染、細胞活力等體外測試，應基于多批次數據制定放行測試公差。
• 基因組完整性檢測（如全基因組測序）有助于了解遺傳變異風險，但要明確基因變化與患者安全相關性，雖無統(tǒng)一基因組穩(wěn)定性標準，可參考已發(fā)表研究，選擇無癌癥相關基因大異常或非同義突變細胞有助于降低致瘤風險，但不能完全認證體內安全性。

4. 臨床前體內評估

4.1 細胞移植的部位

• 神經元細胞移植旨在組織替代或提供局部營養(yǎng)，需將細胞遞送至目標部位。例如中風時在缺血半暗帶移植以拯救細胞和重建神經網絡；ALS 最佳途徑是鞘內注射；PD 治療可將細胞移植到背側紋狀體或黑質。
• 嚙齒動物一到兩個部位移植可實現神經支配，靈長類動物大腦較大，為實現足夠神經支配，PD 臨床研究中每個半球常需三到八個注射道，非人靈長類動物在移植策略評估上因大腦與人類相似具有優(yōu)勢，小動物移植策略不足以模擬人類治療。

4.2 毒性試驗及劑量耐受性

• 界定細胞毒性和劑量耐受性對新藥至關重要。毒性測試應遵循臨床途徑，研究對靶器官及肝臟、心臟、腎臟等非靶器官的毒性作用。
• 高劑量細胞給藥安全風險更大，動物實驗中設置不同劑量組確定最大可行劑量可為臨床研究提供支持，當細胞在體內可能增殖時，劑量確定更具挑戰(zhàn)性，大鼠或小鼠腦內和脊髓接受細胞數量有一定范圍。

4.3 過度生長和致瘤性檢測

• hPSC 衍生細胞安全性需考慮不受控制的增殖和腫瘤形成。過度細胞生長會影響宿主細胞網絡和功能，要通過對足夠數量動物進行組織病理學和免疫組織化學分析研究移植物體積和增殖標志物，移植物體積與移植細胞性質有關，如較年輕或分化程度低的細胞擴增更廣泛，純化神經元制劑細胞損失和移植物尺寸減小。
• 要區(qū)分致癌性（宿主正常細胞受刺激形成腫瘤）和致瘤性（與移植細胞有關），為確定未分化 hPSC 污染情況，一些研究小組進行加標研究。

4.4 體內存活和分布

• 神經細胞移植期望在宿主體內長期存活以替代丟失細胞，但因細胞消化、機械損傷和微環(huán)境改變等，大量移植細胞會死亡，移植 DA 存活率低，移植后第一周對細胞存活很關鍵，抑制 p53、改變聚唾液酸表達或注射 GDNF 有助于提高細胞存活率。
• 雖神經元細胞長距離遷移證據少，但需證明注射后細胞分布，非侵入性細胞追蹤方法可用于監(jiān)測動物，避免多個時間點處死動物。

4.5 體內細胞命運

• 移植的神經元細胞多由 NSC 和未成熟祖細胞組成，需在體內進一步分化成熟。體外分化技術可靠，但體內復雜微環(huán)境會影響細胞命運造成異質性，單細胞 RNA 測序顯示移植的多巴胺能祖細胞可產生多種細胞類型，不同 NSC 系在脊髓產生神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞的比例不同，因此確認細胞產物在體內轉化為所需細胞類型及是否存在危險細胞類型很重要。

4.6 細胞功效評估

• 動物模型療效評估是臨床試驗的先決條件，理想動物模型應再現患者病理病變和行為癥狀。小鼠和大鼠模型因易獲取和成本低常用于療效測試，非人靈長類動物模型在神經系統(tǒng)疾病研究中更具優(yōu)勢，更能準確預測人類細胞劑量效應和療效。
• 應開發(fā)和使用有效的行為評估方法和標準證明細胞產品功效，功能終點包括細胞支配、神經回路重建等方面研究，有助于理解作用機制，鼓勵研究人員發(fā)表臨床前結果以進行嚴格驗證，多項使用 hPSC 衍生神經元細胞的臨床研究正在進行。

5. 挑戰(zhàn)與未來前景

5.1 即用型冷凍保存格式

• 細胞冷凍保存的發(fā)展為細胞替代療法創(chuàng)造了條件，但有效細胞產品面臨配方開發(fā)難題。當前多數冷凍產品輸注前需解凍后清洗、濃縮以去除 DMSO 等賦形劑，這一額外處理增加安全風險，還可能損害細胞穩(wěn)定性。
• 未來配方開發(fā)的主要方向是研發(fā)含更少賦形劑、更簡單（甚至不含 DMSO）的冷凍保存溶液，實現無需額外操作或僅簡單稀釋的即用型神經元細胞產品。甘油等其他冷凍保護劑可作為替代選擇，且地松鼠 iPSC 衍生神經元獨特的抗寒途徑，為促進神經元細胞臨床應用帶來潛力。

5.2 功能檢測的替代標記

• 預測神經成熟和體內結果是細胞置換面臨的挑戰(zhàn)。移植神經元細胞成熟與整合耗時數月，功能評估需大量時間和動物。
• 鑒定替代標志物能顯著提升細胞質量和研究效率，為產品效力測定及放行測試提供基礎。Parmar 團隊通過 RNA-Seq 明確多巴胺能祖細胞基因表達與體內結果的關系，確定了相關標志物，推動了該領域進展。后續(xù)有望發(fā)現更多此類生物標志物，但需投入驗證工作。

5.3 低免疫原性細胞產品

• 免疫排斥是細胞替代療法的關鍵問題，多數試驗采用同種異體細胞產品，而神經元細胞替代療法需植入細胞長期存活。盡管中樞神經系統(tǒng)有免疫特權，但同種異體細胞在大腦中的免疫排斥仍存在。
• 傳統(tǒng)克服方法是使用免疫抑制藥物，但其有副作用，會增加感染和腫瘤形成風險，對老年患者（退行性疾病治療的關鍵人群）威脅更大。
• 生成通用相容細胞是可行途徑。一是通過基因編輯使 hPSC 的 HLA 沉默，該策略已在體外和體內證實可靠，但此類工程通用神經元細胞的應用尚未見報道；二是收集含多種 HLA 類型或單倍型的 hPSC 系，已在非人類靈長類動物中驗證并在臨床研究中嘗試。不過這兩種方法各有利弊，臨床應用前需獲取細胞安全性和低免疫原性的有力證據。

總結來說，hPSC衍生神經細胞臨床研究雖進展迅速，但面臨諸多挑戰(zhàn)，需深入研究以提升神經細胞產品的安全性與有效性，尤其是關注潛在致瘤性和功能效力測定方面 。

參考資料：Sun Y, Feng L, Liang L, Stacey GN, Wang C, Wang Y, Hu B. Neuronal cell-based medicines from pluripotent stem cells: Development, production, and preclinical assessment. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S31-S40. doi: 10.1002/sctm.20-0522. PMID: 34724724; PMCID: PMC8560198.

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